Mai 2010 - Structure des biomacromolécules : voir plus grand et
plus précisément grâce à un nouveau procédé
de marquage
Des chercheurs grenoblois (1) du CEA (2), du CNRS et de l'Université
Joseph Fourier viennent de développer une nouvelle technique de
marquage permettant de repousser les limites de la résonance magnétique
nucléaire (RMN) (3). Ce procédé a permis de détecter,
pour la première fois, des interactions très faibles, jusqu'alors
prédites mais encore jamais caractérisées dans les
macromolécules biologiques. Il a également rendu possible
l'étude d'une protéine de grande taille, avec une résolution
au niveau atomique. Ce nouveau procédé de marquage permettra
notamment une meilleure compréhension du fonctionnement des machineries
biologiques. Ces résultats sont publiés dans les revues
Angewandte Chemie International Edition et Nature Chemistry.
L'un des défis actuels de la biologie est de déterminer,
au niveau atomique, la structure et le fonctionnement des assemblages
de protéines de grande taille. La Résonance magnétique
nucléaire (RMN) est une méthode de choix pour les étudier
en solution. Cependant, cette technique se caractérise par une
faible sensibilité et reste limitée à des molécules
de taille modeste. Pour repousser ces limites, il est nécessaire
d'avoir recours au marquage isotopique spécifique (4) des protéines
consistant à remplacer la plupart des atomes d'hydrogène
par du deutérium (isotope (5) de l'hydrogène, invisible
en RMN). Ainsi, seuls certains atomes d'hydrogène, situés
dans des positions particulières de la protéine, sont conservés
et visibles. Cette technique simplifie en partie l'analyse de la structure
en observant uniquement les atomes d'hydrogène d'intérêt.
Pour simplifier davantage l'analyse d'édifices moléculaires
complexes et ne marquer que certains atomes d'hydrogène avec une
localisation encore plus précise, les chercheurs ont développé
un nouveau protocole de marquage isotopique. « Nous pouvons
désormais incorporer des groupes méthyles 13CH3 de façon
stéréosélective (6) dans les acides aminés
leucine et valine des protéines, et ceci directement lors de leur
biosynthèse. Pour développer ce procédé, nous
avons dû mettre en place et optimiser des modes de synthèse
organique permettant de produire différents précurseurs
(7) spécifiquement enrichis en isotopes stables - deutérium
et carbone-13 », explique Olivier Hamelin, responsable de la
synthèse des précurseurs marqués isotopiquement.
« Ces précurseurs vont maintenant pouvoir être
utilisés pour déterminer la structure de nombreuses biomolécules
complexes. »
Ce marquage stéréosélectif augmente considérablement
la qualité des données RMN et ouvre la porte à de
nombreuses applications. « Nous avons ainsi pu observer une
protéine de 500 kDalton , soit dix fois plus grosse que celles
observées classiquement », précise Jérome
Boisbouvier, spécialiste des développements technologiques
en RMN. « Cette protéine, impliquée dans le système
de contrôle qualité des protéines cellulaires (8),
n'est qu'un exemple des nombreuses molécules que les biologistes
vont désormais pouvoir observer en solution grâce à
ce nouveau procédé ».
Par ailleurs, grâce à l'amélioration de sensibilité
apportée par cette technique, les chercheurs ont pu caractériser
(10), pour la première fois, un type particulier de liaisons hydrogènes,
présent dans les protéines. Ces interactions, jusqu'alors
uniquement prédites d'un point de vue théorique, n'avaient
jamais pu être détectées expérimentalement
à l'intérieur des protéines du fait de leurs très
faibles intensités.
Cette nouvelle stratégie de marquage est compatible avec les techniques
de RMN rapide développées récemment par ces chercheurs.
Celles-ci permettent de réduire le temps expérimental pour
l'observation par RMN d'assemblages moléculaires pouvant atteindre
un mégaDalton. Ces développements technologiques sont des
pas importants vers l'observation en temps réel et à la
résolution atomique de machineries biologiques complexes en pleine
action.
Notes :
(1) Institut de biologie structurale
Jean-Pierre Ebel (CEA / CNRS / Université Joseph Fourier) et Laboratoire
de chimie et biologie des métaux (unité mixte CEA / CNRS
/ Université Joseph Fourier)
(2) Institut de biologie structurale Jean-Pierre Ebel et Institut de recherches
en technologies et sciences pour le vivant de la Direction des sciences
du vivant du CEA
(3) Résonance magnétique nucléaire : phénomène
par lequel un noyau de l'atome considéré absorbe les rayonnements
électromagnétiques d'une fréquence spécifique
en présence d'un fort champ magnétique. Ses applications
concernent la physique, la chimie, l'imagerie médicale et la biologie
structurale.
(4) Marquage isotopique spécifique : substitution de 100 % de l'atome
naturel d'hydrogène par du deutérium et réinsertion
spécifique en quelques sites déterminés de l'atome
naturel d'hydrogène, atome observable par Résonance magnétique
nucléaire.
(5) Deux atomes sont dits isotopes s'ils ont le même nombre de protons
mais un nombre de neutrons différent.
(6) Dans les protéines, les acides aminés leucine et valine
possèdent en bout de chaînes deux méthyles (CH3).
Le remplacement des protons sera stéréosélectif s'il
permet d'introduire spécifiquement des protons dans un seul de
ces méthyles.
(7) Précurseurs : petites molécules chimiques qui vont être
utilisées pour la synthèse d'une molécule. Dans le
cas présent, ces précurseurs vont permettre d'introduire
les isotopes dans les molécules qui doivent être marquées.
(8) Un Dalton est la masse d'un atome d'hydrogène. Un acide aminé
de protéine représente environ 110 Da, un assemblage d'un
méga Dalton contient environ 9 000 acides aminés.
(9) Dans la cellule, un ensemble de grosses machines biologiques sont
chargées de contrôler la qualité des protéines
cellulaires et de les dégrader si nécessaire.
(10) Ce travail a été réalisé en collaboration
avec le Pr. D. Bryce de l'université d'Ottawa : Consulter
le site web
Références :
Direct detection of CH/π interactions in proteins. Michael
Plevin, David Bryce & Jérôme Boisbouvier.
Nature Chemistry (2010), online.
Stereospecific isotopic labeling of methyl groups for NMR spectroscopic
studies of high-molecular-weight proteins. Pierre Gans, Olivier Hamelin,
Remy Sounier, Isabel Ayala, Asunción Durá, Carlos Amero,
Marjolaine Noirclerc-Savoye, Bruno Franzetti, Michael Plevin, & Jérôme
Boisbouvier.
Angewandte Chemie International Edition, (2010); 49, pp. 1958-1962.
Contacts :
Presse :
CNRS : Priscilla Dacher
01 44 96 46 06
priscilla.dacher@cnrs-dir.fr
CEA : Céline Lipari
01 64 50 14 88
celine.lipari@cea.fr
Chercheurs :
Jérôme Boisbouvier
jerome.boisbouvier@ibs.fr
Olivier Hamelin
olivier.hamelin@cea.fr
